Что такое секвенирование ДНК?
Секвенирование ДНК — это метод определения порядка расположения нуклеотидов в ДНК молекула. Секвенирование ДНК произвело революцию в геномике. С 1995 года секвенирование ДНК позволило проанализировать геномы более 50 000 (по состоянию на 2020 год) различных организмов.
Вместе с другими методами ДНК-анализа этот метод также используется, в частности, для исследования генетических заболеваний. Более того, в контексте молекулярного клонирования секвенирование ДНК стало незаменимым в лабораториях молекулярной биологии и генной инженерии.
Под редакцией Кристины Сордс, доктора философии.
Проблемы секвенирования ДНК
Определение биологических последовательностей было нерешенной проблемой в течение десятилетий до середины 1970-х годов, когда были разработаны биохимические или молекулярные методы. В настоящее время даже крупномасштабное секвенирование целых геномов стало сравнительно быстрым и простым.
Однако проблемы секвенирования генома не ограничиваются только прямым считыванием последовательности нуклеиновой кислоты. Из-за технических ограничений в каждой отдельной реакции секвенирования считываются только короткие участки (чтения) ДНК до 1000 пар оснований. Для длинных цепей ДНК метод, известный как обход праймеров, был впервые использован в 1979 году. В этой процедуре последовательность читалась по частям.
В более крупном проекте секвенирования Проект генома человека было секвенировано несколько миллиардов пар оснований. Это было сделано с помощью подхода, известного как секвенирование дробовика. Сегодня мы можем изучать болезни, мишени для лекарств, идентификацию на основе ДНК и т. Д. Благодаря технологии массового параллельного секвенирования ДНК.
При секвенировании дробовиком цепь ДНК сначала разбивается на более мелкие фрагменты нуклеотидов, которые затем секвенируются по основанию. Информация о последовательностях отдельных коротких сегментов затем собирается в полный геном с использованием инструментов биоинформатики.
Последовательность необработанных данных анализируется для получения биологически релевантной информации. Без него любая информация о последовательности остается без научной ценности.
Методы секвенирования
Сегодня доступно несколько методов считывания информации о последовательности ДНК с помощью секвенирующих машин. Долгое время развитие методов секвенирования строилось на секвенировании по Сэнгеру. Современные методы предлагают возможности для ускоренного секвенирования за счет высокопараллельного секвенирования. Новые методы секвенирования часто называют секвенированием следующего поколения.
Классические методы
Метод Максама и Гилберта
Метод был разработан Алланом Максамом и Уолтером Гилбертом в 1977 году. Он основан на двух подходах. Основно-специфическое химическое расщепление ДНК и последующее разделение фрагментов денатурирующим электрофорезом в полиакриламидном геле.
ДНК сначала метят на 5 ‘или 3’ конце радиоактивным фосфатом или нерадиоактивным веществом (биотином, флуоресцеином). Затем в четырех отдельных препаратах конкретные основания сахарно-фосфатного остова ДНК частично (ограниченно) модифицируются и расщепляются. Например, основание гуанин (G) метилируется реагентом диметилсульфатом и удаляется щелочной обработкой пиперидином.
Затем цепь ДНК полностью расщепляется. В каждом препарате образуются фрагменты разной длины, 3′-конец которых всегда расщеплен по определенным основаниям. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле разделяет фрагменты по длине, причем различия в длине разрешаются одним основанием. Сравнивая четыре подхода к гелю, можно прочитать последовательность ДНК.
Этот метод позволил его изобретателям определить последовательность оперона бактериального генома. Сегодня этот метод используется редко, поскольку требует наличия токсичных реагентов. Кроме того, его сложнее автоматизировать, чем разработанный тогда же метод дидезокси Сэнгера.
Метод Дидезокси (Sanger последовательность действий )
Метод дидезокси Сэнгера также называют синтезом обрыва цепи. Это ферментативный метод. Он был разработан Сэнгером и Колсоном примерно в 1975 году. Он был представлен в 1977 году с первой полной последовательностью генома (бактериофаг φX174).
Сэнгер получил Нобелевскую премию по химии в 1980 году за работу по секвенированию ДНК. Он получил премию вместе с Уолтером Гилбертом и Полом Бергом.
Фермент ДНК-полимераза используется для удлинения одной из двух комплементарных цепей ДНК. Двойная спираль ДНК денатурируется нагреванием, после чего отдельные цепи становятся доступными для дальнейшей обработки.
В четырех идентичных в остальном препаратах добавляют одно из четырех оснований в виде дидезоксинуклеозидтрифосфата (ddNTP). Эти завершающие цепь ddNTP не имеют 3′-гидроксигруппы, которая связывает фосфатную группу следующего нуклеотида. Их добавление во вновь синтезированную цепь останавливает удлинение ДНК ДНК-полимеразой из-за отсутствия группы ОН.
В результате образуются фрагменты ДНК разной длины, которые всегда заканчиваются одним и тем же ddNTP в каждой отдельной партии.
После реакции секвенирования меченые продукты отрыва из всех подходов разделяют по длине электрофорезом в полиакриламидном геле.
Затем последовательность может быть считана на фотопленке (рентгеновской пленке) после воздействия радиоактивного геля. Соответствующая комплементарная последовательность представляет собой последовательность используемой одноцепочечной ДНК-матрицы. В настоящее время в качестве реакции секвенирования используется разновидность полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В отличие от ПЦР используется только один праймер, поэтому ДНК амплифицируется только линейно.
В начале 1980-х Фриц М. Поль и его исследовательская группа разработали радиоактивный метод секвенирования ДНК. В этой технологии секвенирования молекулы ДНК будут переноситься на носитель во время электрофоретического разделения.
«Система прямого блоттинга-электрофореза GATC 1500» продавалась компанией GATC Biotech из Констанца. Секвенатор ДНК использовался, например, в европейском проекте генома для секвенирования хромосомы II дрожжей. Saccharomyces cerevisiae .
С начала 1990-х годов используются, в частности, дидезоксинуклеозидтрифосфаты, меченные флуоресцентными красителями. Каждый из четырех ddNTP связан с другим красителем. Эта модификация позволяет добавлять все четыре ддНТФ в один реакционный сосуд.
Разделение на отдельные подходы и обращение с радиоизотопами больше не требуется. Полученные продукты обрыва цепи разделяются капиллярным электрофорезом и возбуждаются лазером до флуоресценции.
Таким образом, ddNTP на конце каждого фрагмента ДНК демонстрируют флуоресценцию разных цветов. Эта флуоресценция может быть обнаружена детектором. На электрофореграмме непосредственно показана последовательность оснований секвенированной цепи ДНК.
Современные подходы
С ростом значения секвенирования ДНК в исследованиях и диагностике были разработаны методы, позволяющие увеличить пропускную способность. Теперь возможно секвенировать полный геном человека примерно за 8 дней. Соответствующие методы называются секвенированием второго поколения.
Разные компании разработали методы с разными преимуществами и недостатками. Помимо перечисленных здесь, есть и другие. Секвенирование ДНК второго поколения было названо журналом Nature Methods «методом 2007 года».
Секвенирование ДНК с помощью пиросеквенирования
Пиросеквенирование использует ДНК-полимеразу для синтеза контрцепи ДНК, хотя тип ДНК-полимеразы все еще может варьироваться.
Смесь ДНК лигируют с адаптером ДНК и связывают с гранулами через дополнительную последовательность адаптера. Гранулы, заполненные ДНК, помещают на пластину с порами. Обнаружение зависит от светового датчика.
ДНК-полимераза наблюдается «в действии», поскольку она последовательно присоединяет отдельные нуклеотиды к вновь синтезированной цепи ДНК. Успешное введение нуклеотида преобразуется в световой сигнал, который обнаруживается детектором. Секвенируемая ДНК служит матричной цепью и доступна в однонитевой форме.
Удлинение цепи ДНК осуществляется путем комплементарного добавления одного из четырех типов дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP). Когда добавляется соответствующий нуклеотид, получается сигнал. Добавление неподходящего NTP не приводит к обнаружению сигнала. Затем существующий NTP уничтожается и добавляется другой тип; это продолжается до тех пор, пока снова не появится реакция.
Это реакция, опосредованная люциферазой. Когда комплементарный нуклеотид включается в ДНК-полимеразу, высвобождается пирофосфат (PPi). Пирофосфат превращается в аденозинтрифосфат (АТФ) с помощью АТФ-сульфурилазы.
АТФ запускает люциферазную реакцию, которая превращает люциферин в оксилюциферин. Это, в свою очередь, приводит к обнаружению светового сигнала, сила которого пропорциональна потребленному АТФ.
Пиросеквенирование использовалось для определения частоты определенных ген мутации, например, при исследовании генетических заболеваний. Пиросеквенирование можно легко автоматизировать, и оно подходит для высокопараллельного анализа образцов ДНК.
Секвенирование путем гибридизации
Для этого короткие участки ДНК (олигонуклеотиды) фиксируют рядами и столбцами на стеклянном носителе (ДНК-чипе или микрочипе).
Фрагменты ДНК, подлежащие секвенированию, метят красителями и наносят на олигонуклеотидную матрицу. Это позволяет комплементарным фиксированным и свободным участкам ДНК гибридизоваться друг с другом. После смывания несвязавшихся фрагментов картина гибридизации считывается по цветным меткам и их силе.
Последовательности фиксированных олигонуклеотидов и их перекрывающиеся области известны. Следовательно, цветовой узор в конечном итоге может быть использован для определения основной общей последовательности неизвестной ДНК.
Система ионно-полупроводникового секвенирования ДНК
В Ион Торрент Метод использует технологию полупроводникового чипа для выполнения прямого неоптического секвенирования генома с использованием интегральных схем.
Данные секвенирования получают непосредственно при обнаружении ионов, продуцируемых матрично-зависимыми ДНК-полимеразами. Полупроводниковый чип, используемый в этом методе, имеет ионно-чувствительный полевой транзистор. Его сенсоры расположены в сетке из 1,2 миллиона лунок, в которых протекает полимеразная реакция. Эта сетка обеспечивает параллельное и одновременное обнаружение реакций независимой последовательности.
Используется дополнительная технология металл-оксид-полупроводник (CMOS), которая обеспечивает экономичную реакцию при высокой плотности точек измерения.
Секвенирование с мостиковым синтезом
Эта технология секвенирования известна как секвенирование с мостиковым синтезом Solexa / Illumina. Двухцепочечную ДНК, подлежащую секвенированию, лигируют на обоих концах с разными последовательностями адаптера на каждом конце.
Затем ДНК денатурируют, лигируют на носитель в одноцепочечной форме после разведения. И дополнительно усиливается in situ мостовым усилением. Это создает отдельные области (кластеры) амплифицированной ДНК на пластине-носителе, которые имеют одинаковую последовательность внутри кластера.
ПЦР-реакция проводится с четырьмя разноцветными флуоресцентными субстратами, обрывающими цепь. Соответствующая база, вводимая за цикл, определяется в кластере в режиме реального времени.
Двухбазовое кодирование
Секвенирование с помощью обнаружения лигирования олиго ( СОЛИД ) от Applied Biosystems представляет собой вариант секвенирования путем лигирования.
Библиотеку ДНК разбавляют и присоединяют к микрогранулам с помощью ДНК-полимеразы. Затем ДНК амплифицируют в эмульсионной ПЦР. Таким образом, каждая микробусинка содержит несколько копий одной последовательности ДНК. Микрошарики модифицированы на 3′-конце, так что их можно индивидуально прикрепить к несущей пластине.
После связывания праймера добавляются четыре разных расщепляемых зонда, каждый из которых помечен различным флуоресцентным цветом. Они связываются с матрицей ДНК посредством первых двух нуклеотидов (CA, CT, GG, GC). Затем микрогранулы лигируют ДНК-лигазой. Затем зонды отщепляются, освобождая метки.
Используя до пяти праймеров, каждое основание в последовательности ДНК определяют по меньшей мере в двух различных реакциях лигирования.
Секвенирование ДНК с парными концами
Четко идентифицируемый сигнал может быть получен путем создания коротких фрагментов ДНК из концевых концов последовательности ДНК. Этот метод секвенирования ДНК также известен как секвенирование парных концевых меток, PETS.
Секвенирование ДНК третьего поколения
Впервые секвенирование третьего поколения измеряет реакцию отдельных молекул как эксперимент с одной молекулой.
Это устраняет необходимость амплификации с помощью ПЦР перед секвенированием. Полимеразы демонстрируют предвзятость связывания с некоторыми последовательностями ДНК. Следовательно, это позволяет избежать неравномерной амплификации термостабильными ДНК-полимеразами.
Таким образом, некоторые последовательности можно упустить. Кроме того, можно исследовать геном отдельной клетки.
Выпущенный сигнал записывается в реальном времени. При секвенировании ДНК третьего поколения регистрируются два разных сигнала в зависимости от используемого метода. Они выпускают протоны или флуорофоры. Секвенирование ДНК и РНК отдельных клеток было названо журналом Nature Methods «методом 2013 года».
Секвенирование нанопор
Секвенирование нанопор основан на изменении потока ионов через нанопоры, внедренные в искусственно созданную мембрану. Нанопоры — это биологические или синтетические поры или даже полусинтетические поры. Нанопора встроена в искусственную мембрану, которая имеет особенно высокое электрическое сопротивление.
Пора постоянно открыта, в отличие от обычных ионных каналов. Это обеспечивает постоянный поток ионов через мембрану после приложения потенциала. Молекулы ДНК, проходящие через пору, приводят к снижению тока. Это уменьшение тока имеет определенную амплитуду для каждого нуклеотида, которую можно измерить и отнести к соответствующему нуклеотиду.
При однонитевом секвенировании двухцепочечная цепь ДНК разделяется геликазой и вводится в нанопору.
В случае поры MspA четыре нуклеотида ДНК одновременно находятся внутри поры. Скорость прохождения зависит, среди прочего, от разницы значений pH через мембрану. Конкретные изменения ионного тока для каждого из четырех нуклеотидов позволяют считывать последовательность.
Оценка выполняется, например, с помощью программного обеспечения Poretools. Преимущество этого метода в том, что он имеет постоянную точность даже для длинных цепей ДНК. Вариант метода используется для секвенирования белков.
Технология секвенирования нанопор разрабатывается британской компанией Oxford Nanopore Technologies. Их секвенсор «MinION» изначально был доступен только в рамках «Программы раннего доступа». Но с 2015 года он доступен через обычные каналы распространения.
Перед тем, как уйти, ознакомьтесь с нашим секвенированием следующего поколения Секвенирование всего генома !
